મોલેક્યુલર નિદાન, સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી પીસીઆર તકનીક અને સિદ્ધાંત

પીસીઆર, એ પોલિમરેઝ ચેઇન રિએક્શન છે, જે DNA પોલિમરેઝના ઉદ્દીપન હેઠળ સિસ્ટમમાં dNTP, Mg2+, વિસ્તરણ પરિબળો અને એમ્પ્લીફિકેશન એન્હાન્સમેન્ટ ફેક્ટરના ઉમેરાને સંદર્ભિત કરે છે, જેમાં પેરેંટ ડીએનએનો ટેમ્પલેટ તરીકે અને ચોક્કસ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને વિસ્તરણના પ્રારંભિક બિંદુ તરીકે, ડિનેચ્યુરેશન, એનેલીંગ, એક્સ્ટેંશન વગેરેના પગલાઓ દ્વારા, પિતૃ સ્ટ્રાન્ડ ટેમ્પ્લેટ ડીએનએના પૂરક પુત્રી સ્ટ્રાન્ડ ડીએનએની ઈન વિટ્રો પ્રતિકૃતિની પ્રક્રિયા ઝડપથી અને વિશિષ્ટ રીતે વિટ્રોમાં કોઈપણ લક્ષ્ય ડીએનએને વિસ્તૃત કરી શકે છે.

1. હોટ સ્ટાર્ટ પીસીઆર

પરંપરાગત પીસીઆરમાં એમ્પ્લીફિકેશનનો પ્રારંભ સમય એ પીસીઆર મશીનને પીસીઆર મશીનમાં મૂકવાનો નથી, અને પછી પ્રોગ્રામ એમ્પ્લીફિકેશન શરૂ થાય છે.જ્યારે સિસ્ટમ રૂપરેખાંકન પૂર્ણ થાય છે, ત્યારે એમ્પ્લીફિકેશન શરૂ થાય છે, જે બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનનું કારણ બની શકે છે, અને હોટ-સ્ટાર્ટ PCR આ સમસ્યાને હલ કરી શકે છે.

હોટ સ્ટાર્ટ પીસીઆર શું છે?પ્રતિક્રિયા પ્રણાલી તૈયાર થયા પછી, એન્ઝાઇમ મોડિફાયરને પ્રતિક્રિયાના પ્રારંભિક હીટિંગ તબક્કા દરમિયાન અથવા "હોટ સ્ટાર્ટ" તબક્કા દરમિયાન ઊંચા તાપમાને (સામાન્ય રીતે 90 ° સે કરતા વધારે) પર મુક્ત કરવામાં આવે છે, જેથી DNA પોલિમરેઝ સક્રિય થાય.સક્રિયકરણનો ચોક્કસ સમય અને તાપમાન DNA પોલિમરેઝ અને હોટ-સ્ટાર્ટ મોડિફાયરની પ્રકૃતિ પર આધારિત છે.આ પદ્ધતિ મુખ્યત્વે ડીએનએ પોલિમરેઝની પ્રવૃત્તિને રોકવા માટે એન્ટિબોડીઝ, એફિનિટી લિગાન્ડ્સ અથવા રાસાયણિક સંશોધકો જેવા સંશોધકોનો ઉપયોગ કરે છે.ડીએનએ પોલિમરેઝની પ્રવૃત્તિ ઓરડાના તાપમાને અટકાવવામાં આવતી હોવાથી, હોટ સ્ટાર્ટ ટેક્નોલોજી પીસીઆર પ્રતિક્રિયાઓની વિશિષ્ટતાને બલિદાન આપ્યા વિના ઓરડાના તાપમાને બહુવિધ પીસીઆર પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીઓ તૈયાર કરવા માટે મોટી સગવડ પૂરી પાડે છે.

2. RT-PCR

RT-PCR (રિવર્સ ટ્રાંસ્ક્રિપ્શન PCR) એ mRNA માંથી cDNA માં રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન અને એમ્પ્લીફિકેશન માટે ટેમ્પલેટ તરીકે ઉપયોગ કરવા માટેની પ્રાયોગિક તકનીક છે.પ્રાયોગિક પ્રક્રિયા પ્રથમ પેશીઓ અથવા કોષોમાં કુલ આરએનએ કાઢવાની છે, પ્રાઈમર તરીકે ઓલિગો (ડીટી) નો ઉપયોગ કરો, સીડીએનએને સંશ્લેષણ કરવા માટે રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસનો ઉપયોગ કરો અને પછી લક્ષ્ય જનીન મેળવવા અથવા જનીન અભિવ્યક્તિ શોધવા માટે પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશન માટે નમૂના તરીકે સીડીએનએનો ઉપયોગ કરો.

3. ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆર

ફ્લોરોસન્ટ જથ્થાત્મક પીસીઆર (રીઅલ-ટાઇમ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​પીસીઆર,RT-qPCR) એ PCR પ્રતિક્રિયા પ્રણાલીમાં ફ્લોરોસન્ટ જૂથોને ઉમેરવાની પદ્ધતિનો સંદર્ભ આપે છે, સમગ્ર પીસીઆર પ્રક્રિયાને વાસ્તવિક સમયમાં મોનિટર કરવા માટે ફ્લોરોસન્ટ સિગ્નલોના સંચયનો ઉપયોગ કરીને અને અંતે નમૂનાનું જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ કરવા માટે પ્રમાણભૂત વળાંકનો ઉપયોગ કરીને.સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી qPCR પદ્ધતિઓમાં SYBR ગ્રીન I અને TaqMan નો સમાવેશ થાય છે.

4. નેસ્ટેડ PCR

નેસ્ટેડ પીસીઆર એ પીસીઆર એમ્પ્લીફિકેશનના બે રાઉન્ડ માટે પીસીઆર પ્રાઈમરના બે સેટના ઉપયોગનો સંદર્ભ આપે છે અને બીજા રાઉન્ડનું એમ્પ્લીફિકેશન ઉત્પાદન લક્ષ્ય જીન ફ્રેગમેન્ટ છે.

જો પ્રાઈમર્સની પ્રથમ જોડી (બાહ્ય પ્રાઈમર્સ) ના મેળ ખાતા બિન-વિશિષ્ટ ઉત્પાદનને વિસ્તૃત કરવા માટેનું કારણ બને છે, તો તે જ બિન-વિશિષ્ટ પ્રદેશને પ્રાઈમર્સની બીજી જોડી દ્વારા ઓળખવામાં આવે છે અને એમ્પ્લીફાય કરવાનું ચાલુ રાખવાની શક્યતા ઘણી ઓછી છે, તેથી પ્રાઈમર્સની બીજી જોડી દ્વારા એમ્પ્લીફિકેશન, પીસીઆરની વિશિષ્ટતામાં સુધારો કરવામાં આવ્યો છે.પીસીઆરના બે રાઉન્ડ કરવાનો એક ફાયદો એ છે કે તે મર્યાદિત પ્રારંભિક ડીએનએમાંથી પૂરતા ઉત્પાદનને વિસ્તૃત કરવામાં મદદ કરે છે.

5. ટચડાઉન પીસીઆર

ટચડાઉન પીસીઆર એ પીસીઆર ચક્રના પરિમાણોને સમાયોજિત કરીને પીસીઆર પ્રતિક્રિયાની વિશિષ્ટતાને સુધારવા માટેની એક પદ્ધતિ છે.

ટચડાઉન પીસીઆરમાં, પ્રથમ થોડા ચક્રો માટે એનિલિંગ તાપમાન પ્રાઇમર્સના મહત્તમ એનિલિંગ તાપમાન (Tm) કરતા થોડા ડિગ્રી ઉપર સેટ કરવામાં આવે છે.ઉચ્ચ એનિલિંગ તાપમાન બિન-વિશિષ્ટ એમ્પ્લીફિકેશનને અસરકારક રીતે ઘટાડી શકે છે, પરંતુ તે જ સમયે, ઉચ્ચ એનિલિંગ તાપમાન પ્રાઇમર્સ અને લક્ષ્ય ક્રમના વિભાજનને વધારે છે, જેના પરિણામે પીસીઆર ઉપજમાં ઘટાડો થાય છે.તેથી, પ્રથમ થોડા ચક્રમાં, સિસ્ટમમાં લક્ષ્ય જનીનની સામગ્રીને વધારવા માટે, એન્નીલિંગ તાપમાન સામાન્ય રીતે ચક્ર દીઠ 1°C દ્વારા ઘટાડવા માટે સેટ કરવામાં આવે છે.જ્યારે એનિલિંગ તાપમાનને મહત્તમ તાપમાન સુધી ઘટાડવામાં આવે છે, ત્યારે બાકીના ચક્ર માટે એનિલિંગ તાપમાન જાળવવામાં આવે છે.

6. ડાયરેક્ટ પીસીઆર

ડાયરેક્ટ પીસીઆર એ ન્યુક્લીક એસિડ આઇસોલેશન અને શુદ્ધિકરણની જરૂરિયાત વિના સીધા નમૂનામાંથી લક્ષ્ય ડીએનએના એમ્પ્લીફિકેશનનો સંદર્ભ આપે છે.

બે પ્રકારના ડાયરેક્ટ પીસીઆર છે:

સીધી પદ્ધતિ: થોડી માત્રામાં નમૂના લો અને તેને પીસીઆર ઓળખ માટે સીધા જ પીસીઆર માસ્ટર મિક્સમાં ઉમેરો;

ક્રેકીંગ મેથડ: સેમ્પલ સેમ્પલ કર્યા પછી, તેને લીસેટમાં ઉમેરો, જીનોમ રીલીઝ કરવા માટે લીસેટ કરો, થોડી માત્રામાં લીસેડ સુપરનેટન્ટ લો અને તેને પીસીઆર માસ્ટર મિક્સમાં ઉમેરો, પીસીઆર ઓળખ કરો.આ અભિગમ પ્રાયોગિક કાર્યપ્રવાહને સરળ બનાવે છે, હાથ પરનો સમય ઘટાડે છે અને શુદ્ધિકરણના પગલાં દરમિયાન DNA નુકશાન ટાળે છે.

7. SOE PCR

ઓવરલેપ એક્સ્ટેંશન PCR (SOE PCR) દ્વારા જનીનનું વિભાજન, PCR ઉત્પાદનોને ઓવરલેપિંગ સાંકળો બનાવવા માટે પૂરક છેડાઓ સાથે પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરે છે, જેથી અનુગામી એમ્પ્લીફિકેશન પ્રતિક્રિયામાં, ઓવરલેપિંગ સાંકળોના વિસ્તરણ દ્વારા, એ ટેકનિકના વિવિધ સ્ત્રોતો જેમાં એમ્પ્લીફાઇડ ટુકડાઓ ઓવરલેપ થાય છે. અને એકસાથે વિભાજિત.આ તકનીકમાં હાલમાં બે મુખ્ય એપ્લિકેશન દિશાઓ છે: ફ્યુઝન જનીનોનું નિર્માણ;જનીન સાઇટ-નિર્દેશિત પરિવર્તન.

8. IPCR

ઇન્વર્સ પીસીઆર (આઈપીસીઆર) બે પ્રાઇમર્સ સિવાયના અન્ય ડીએનએ ટુકડાઓને વિસ્તૃત કરવા માટે વિપરીત પૂરક પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરે છે, અને જાણીતા ડીએનએ ટુકડાની બંને બાજુએ અજાણ્યા ક્રમને વિસ્તૃત કરે છે.

IPCR મૂળ રીતે નજીકના અજ્ઞાત પ્રદેશોના ક્રમને નિર્ધારિત કરવા માટે બનાવવામાં આવ્યું હતું, અને મોટે ભાગે તેનો ઉપયોગ જનીન પ્રમોટર સિક્વન્સનો અભ્યાસ કરવા માટે થાય છે;ઓન્કોજેનિક રંગસૂત્ર પુનઃ ગોઠવણી, જેમ કે જીન ફ્યુઝન, ટ્રાન્સલોકેશન અને ટ્રાન્સપોઝિશન;અને વાયરલ જનીન સંકલન, હવે સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાય છે સાઇટ-નિર્દેશિત મ્યુટાજેનેસિસ માટે, ઇચ્છિત પરિવર્તન સાથે પ્લાઝમિડની નકલ કરો.

9. ડીપીસીઆર

ડિજિટલ પીસીઆર (ડીપીસીઆર) એ ન્યુક્લીક એસિડ પરમાણુઓના સંપૂર્ણ પ્રમાણીકરણ માટેની તકનીક છે.

ન્યુક્લીક એસિડ પરમાણુઓના પરિમાણ માટે હાલમાં ત્રણ પદ્ધતિઓ છે.ફોટોમેટ્રી ન્યુક્લીક એસિડ પરમાણુઓના શોષણ પર આધારિત છે;રીઅલ-ટાઇમ ફ્લોરોસન્ટ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​PCR (રિયલ ટાઇમ PCR) Ct મૂલ્ય પર આધારિત છે, અને Ct મૂલ્ય એ ફ્લોરોસેન્સ મૂલ્યને અનુરૂપ ચક્ર નંબરનો સંદર્ભ આપે છે જે શોધી શકાય છે;ડિજિટલ પીસીઆર એ ન્યુક્લીક એસિડનું પ્રમાણીકરણ ગણવા માટે સિંગલ-મોલેક્યુલ પીસીઆર પદ્ધતિ પર આધારિત નવીનતમ ક્વોન્ટિટેટિવ ​​ટેક્નોલોજી છે જે ચોક્કસ જથ્થાત્મક પદ્ધતિ છે.